醫學碩士論文開題報告

　　題目：血清tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白在nec早期診斷中的臨床意義

　　一、立論依據

　　(包括研究意義、國內外研究現狀分析，并附主要參考文獻及出處)

　　對基礎研究，著重結合國際科學發展趨勢，論述本課題的科學意義;

　　對應用基礎研究，著重結合學科前沿、圍繞國民經濟和社會發展中的重要科技問題，論述其應用情景。

　　(一) 研究意義：

　　新生兒壞死性小腸結腸炎(nec)是新生兒時期嚴重威脅生命的消化系統急癥，以早產兒、小于胎齡兒發病者較多，在nicu患兒中的發病率高達10%，是早產兒死亡的重要原因之一。臨床以腹脹、腹瀉、黏液血便和膽汁樣嘔吐為主要表現，腹部x線平片以腸壁囊樣積氣為特征，腸道病變范圍可局限或廣泛，回腸累及最多，黏膜呈凝固性壞死，粘膜下層彌漫性出血或壞死，嚴重者腸壁全層壞死甚至穿孔。

　　目前有很多方法用于診斷nec。除了可以根據臨床表現診斷外，腹部x線片是最常用的輔助檢查方法，雖然其用于診斷nec的特異度較高，但對于早期診斷nec幫助不大，目前也有很多關于il-8、il-10、il-1受體拮抗劑等生化指標用于診斷nec的研究，但缺乏較好的用于早期診斷nec的血生化指標。

　　tlr是由nomuria等在哺乳動物體內發現與果蠅toll蛋白相似的一種蛋白。tlr在不同細胞的表達和識別不同細胞因子在多種疾病的發病機制中起重要作用，目前研究發現tlr參與腫瘤、腸道免疫性疾病等多種疾病的發病。在人類體內發現的tlr家族共有10個成員，其中tlr4是近年來研究較多的其中一個，tlr4主要表達在內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及dc上。

　　i-fabp是由小腸單層柱狀上皮細胞分泌的一種小分子蛋白質，占成熟的細胞基質蛋白的2%。腸缺血早期僅有黏膜受累時即可因為細胞通透性升高而導致ifabp釋放入血，具有較好的器官特異性。

　　本研究旨在通過檢測nec患兒血清中的tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白，監測其在nec中的動態變化，作為nec嚴重程度的生化指標，可為輔助診斷nec提供依據，達到早期干預的目的。

　　(二)國內外研究現狀分析：

　　1、tlr4上調導致nec發生的機制研究

　　1)、與lps結合后，被激活的tlr4可以通過髓樣分化因子88(myd88)依賴性和非依賴性兩個途徑介導炎癥因子的釋放。其中myd88依賴性途徑主要介導nf-kb活化和細胞因子產生，而myd88的非依賴性途徑主要誘導lps的干擾素(ifn)，以及干擾素誘導蛋白10(ip10)基因、糖皮質激素衰減反應基因16(garg-16)、干擾素調節基因1(irg-1)的表達和dc的成熟，激活下游nf-kb、c-jun氨基末端激酶(jnk)和促分裂原活化蛋白激酶(mapk)p38信號通路，誘導促炎癥因子如白細胞介素-1(il-1)6、12和腫瘤壞死因子-α(tnf-α)等的表達。

　　2)、chan等研究發現，tlr4激活后能影響腸道粘膜的修復能力，此與其減少腸道細胞增殖、降低內皮細胞基底部粘附力及減少內皮細胞移動到受損位置的數量有關。sodhi等研究證明，tlr4通過抑制細胞的增殖分化作用于wnt-β-5信號系統，使腸道粘膜修復能力受損，加重nec的病理變化。

　　3)、最新研究表明，tlr4不僅可以與lps結合誘導炎癥反應、損傷腸道粘膜導致nec發生，許多分子蛋白如纖維結合蛋白、透明質酸。硫酸肝素等均能激活tlr4，在無外來病原菌時tlr4表達可能增高，釋放大量炎癥因子從而發生nec的炎癥瀑布鏈式反應。這一發現，可以解釋一些無明顯感染因素引起的nec。

　　2、細菌及其產物如何引起腸上皮細胞的損傷探討

　　血小板活化因子(paf)在nec的發生中起重要作用。有研究應用缺氧、低溫、人工喂養、細菌感染等方法制成了nec的動物模型，結果發現腸上皮的paf及其受體的表達增高，阻斷paf的受體表達后nec的發生率明顯下降。paf表達增高可使腸壁血管通透性增高、白細胞游出、細胞粘附分子的合成增多及活性氧生成增加，從而損傷腸壁。有研究表明，paf可活化腸上皮細胞的stat，使磷酯酶a2及內皮素一1的合成增加，并可通過上bax的表達而誘導腸上皮細胞凋亡，從而損傷腸上皮細胞、破壞細胞問的連接而引起細菌移位。另外，paf還可誘導腸上皮細胞產生tlr4，后者可活化ikk，從而激活nfxb而引起炎癥級聯反應。如果敲除tlr4，則nec的發生率明顯降低，說明tlr4在nec的發生中也有重要作用。

　　3、沈滌華等研究表明i—fabp可以作為早期腸缺血較理想的生物學指標，國外學者研究發現nec患兒血清i-fabp水平明顯升高，且與nce嚴重程度有關。

　　4、 thuijls等研究發現重癥nec患兒在早期血i-fabp水平即明顯升高。當臨床出

　　現輕度腹脹，大便隱血陽性懷疑nec時，血、尿i—fabp水平在發展成為重癥nec的患兒

　　會明顯高于診斷為其他疾病和病情穩定在neci期或ⅱ期的患兒。

　　主要參考文獻

　　1、 hans van goudoever，陳超，張蓉.新生兒壞死性小腸結腸炎的熱點問題.中國循證兒科雜志 ，06(5).

　　2、 鄒靜靜，陳運彬.toll樣受體在新生兒壞死性小腸結腸炎中的表達及作用.中國新生兒科雜志 ,27(5).

　　3、 李志杰，劉靖華，姜勇.toll樣受體的發現及其研究進展.中國危重病急救醫學，,15:694-697.

　　4、 viriyakosol s,tobias ps,kitchens rl,et al..md-2 binds to bacterial lipopolysaccharide.j biol chem，,276:38044-38051.

　　5、 johnson gb, bruun gj,kodaira y,et al.receptor-mediated monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparin

　　sulfate by toll-like receptor4.j immunol，,168:5233-5239.

　　6、 gribar sc,sodhi cp,richardson wm,et al.reciprocal expression and signalingof tlr4 and tlr9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.j immunol，,182:636-646.

　　7、 馮杰雄.美國新生兒壞死性小腸結腸炎研究現狀.中華小兒外科雜志.，27(7).

　　8、 沈滌華，施誠仁，吳燕，等.腸脂肪酸結合蛋白(i-fabp)在腸缺血早期診斷的意義[j].中華小兒外科雜志，，25(2)：176—179.

　　二、研究方案

　　1.研究目標、研究內容和擬解決的關鍵問題

　　nec分三期：

　　一期為可疑病例，有非特異性癥狀，此時患兒體溫不穩定，嗜睡、呼吸暫停，胃腸道癥狀包括吃奶差、胃潴留、嘔吐、輕微腹脹，腹部x線平片可以正常或腸擴張。

　　二期為確診病例;

　　三期為重癥病例，死亡率高。

　　研究目標：

　　通過檢測血清tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白(i-fabp)水平，探尋兩者在早期診斷新生兒壞死性小腸結腸炎(nec)中的價值。

　　研究內容：

　　實驗分組

　　實驗組：共二組

　　早期nec組：nec一期患兒

　　晚期nec組：nec二期患兒、nec三期患兒。

　　對照組：正常新生兒

　　所選病例均為早產兒

　　各組研究對象均空腹采血(時機：納入實驗組后24小時內)。

　　對照組于出生后1—5 d內抽血檢查。

　　標本：使用不含熱原和內毒素的試管，室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

　　用elisa方法測定血清中tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白水平。

　　試劑盒：上海裕平生物科技有限公司生產的人toll樣受體4(tlr4)elisa試劑盒和i-fabp試劑盒。

　　對比檢測結果，觀察實驗組中各期患兒tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白水平，與對照組進行比較。

　　擬解決的關鍵問題：

　　通過本研究觀察早期nec組和晚期nec組tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白水平，各期間tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白水平是否存在差異。

　　2.擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析

　　研究方法：

　　采用病例對照研究方法分析tlr4和腸型脂肪酸結合蛋白在nec患兒血清中的濃度變化，探討二者與nec的關系。

　　統計學分析：

　　采用spssl6.0統計軟件。

　　正態分布的計量資料采用數據以均數±標準差表示, 組間比較采用單項方差分析，兩兩比較應用lsd法;

　　非正態分布計量資料采用中位數(四分位間距)(m(q))表示，組間比較采用秩和檢驗;

　　計數資料采用構成比表示，統計學分析采用χ2檢驗或fisher精確檢驗

　　血清tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白(i-fabp)水平與nec嚴重程度的相關性分析采用spearman相關分析

　　p<0.05表示差異有統計學意義

　　技術路線：

　　選取合適的實驗組和對照組→采集血標本→進行試驗→整理數據→數據統計分析

　　→撰寫論文

　　3. 本課題的創新之處

　　通過研究，探索性發現能早期診斷nec的較敏感的生化指標，為診斷提供依據 。

　　4、研究計劃及預測進展

　　XX年6月-XX年2月，閱讀文獻，論證課題可行性，并報經醫院倫理委員會通過

　　XX年2月-XX年2月，標本采集;

　　XX年3月，試驗階段;

　　XX年3月-XX年5月，完成科研論文。

　　4. 預期研究成果

　　nec患兒血清中的tlr4及腸型脂肪酸結合蛋白水平與嚴重程度呈正相關。

　　三、研究基礎

　　1.與本課題有關的，前期研究工作積累和已取得的研究工作成績

　　1)本人從事新生兒科工作，對nec較為常見，病例易得到。

　　2)前期已采集大量的血標本。

　　3)已閱讀大量的相關文獻，為研究工作打好基礎。

　　2.已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑(包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況)

　　1)血標本易采集，

　　2)試驗條件已達到，

　　3)試劑盒易購買，

　　4)試驗條件已達到。

　　3.近期已發表與本課題有關的主要論著目錄

　　1、陸妹 朱小瑜 劉登禮 陸亞東 •新生兒壞死性小腸結腸炎危險因素臨床分析•中國新生兒科雜志••27(6) •382

　　2、李粹 任雪云 蔡文仙 牛峰海•細胞因子及腸脂肪酸結合蛋白在新生兒壞死性小腸結腸炎早期診斷中的價值探討•山東醫藥••53(14)•50

　　3、秦嘉麗 韋紅 李祿全 王佚•血清腸型脂肪酸結合蛋白在診斷新生兒壞死性小腸結腸炎中的意義•中華小兒外科雜志••34(8)•590

　　4、許笑南 何少茹 鄭曼利 •新生兒壞死性小腸結腸炎各期危險因素差異分析•中華實用兒科臨床雜志••28(19) •1483